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Biozellen®基質(zhì)膠特點(diǎn)：

1、100%植物源材料，無任何動(dòng)物成分；

2、胺基酸序列100%人源化；

3、可調(diào)控基質(zhì)膠硬度進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)；

4、3D細(xì)胞/類器官培養(yǎng)種類數(shù)量范圍更廣；

5、無人畜共通病原菌或毒素風(fēng)險(xiǎn)；

6、于醫(yī)療級(jí)生物原料；

7、高活性、高純度、可融化；

8、2年保存時(shí)間；

9、3D培養(yǎng)結(jié)束后基質(zhì)膠可以溫和融化，并保留3D細(xì)胞/類器官結(jié)構(gòu)完整性；

Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝

Catalog No. B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10

Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit

Storage Store at-20℃. 1年保存.

一、產(chǎn)品描述

Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠套裝包含整套基質(zhì)膠、膠體固定液、膠體溶解液，可應(yīng)用到3D細(xì)胞培養(yǎng)與微環(huán)境應(yīng)用等；本試劑盒操作便利且可調(diào)控基質(zhì)膠硬度進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)試；植物膠體可快速形成水凝膠，請(qǐng)操作前詳細(xì)閱讀此使用指南。

（Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠材料為植物來源，無動(dòng)物成分）

二、應(yīng)用

•3D類器官培養(yǎng)。

•3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗(yàn)

•細(xì)胞侵襲

•細(xì)胞遷移

•小鼠皮下成瘤

•適合用于3D細(xì)胞藥物篩檢平臺(tái)

•細(xì)胞生長(zhǎng)和分化

•代謝/毒理學(xué)研究

•體外和體內(nèi)血管生成分析

三、適用細(xì)胞種類

• 原代細(xì)胞 • 干細(xì)胞

四、試劑盒組分

五、使用步驟：

A、試劑制備

A基質(zhì)膠：將A基質(zhì)膠溶于37℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*融解.

C緩沖溶液(1X)制備：使用前將10X C緩沖溶液用冰的無細(xì)胞培養(yǎng)液(例如：無血清DMEM、opt-MEM) 制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .

D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.

B、Biozellen®3D類器官培養(yǎng)基質(zhì)膠的制備

全部步驟需要在無菌環(huán)境內(nèi)操作，操作步驟如下：

1. 將24孔培養(yǎng)板放置于冰箱或者冰上預(yù)冷。

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后取 2×105~2×107 細(xì)胞與 0.5ml 37℃ 培養(yǎng)基均勻混合，并與0.5ml 37℃ A膠按照 1:1 等比例均勻混合，最終細(xì)胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溶液與條件進(jìn)行試驗(yàn)。

3.取 20-40 微升步驟 2 含細(xì)胞的混合 A 膠溶液滴于步驟 1 預(yù)冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內(nèi)成膠。注: 測(cè)試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進(jìn)行確認(rèn)。

4.待膠體成膠后，添加1毫升冰的1X C緩沖溶液，并蓋過步驟3 的膠溶液，固定 15 分鐘。

5.待15分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細(xì)胞生長(zhǎng)之培養(yǎng)基溶液。

6將含有細(xì)胞的膠于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行7~14天的培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞球體的形成，按正常培養(yǎng)基更換頻率進(jìn)行更換操作。

C、溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序

小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用1X PBS進(jìn)行清洗。

小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應(yīng) 5分鐘。

溫和的用1毫升移液管吸取，直到膠滴*溶解。

將含有細(xì)胞球體的溶液吸入1.5 毫升離心管，用1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，移除上清液體并收集細(xì)胞球體做分析。

D、收集單顆細(xì)胞準(zhǔn)備程序

在分離單細(xì)胞前，先按上述溶膠與收集細(xì)胞球體準(zhǔn)備程序進(jìn)行操作

1. 添加trypsin-EDTA并與收集的細(xì)胞球體于37°C混合反應(yīng)。

2. 用1毫升移液管混合，直到細(xì)胞體*分解。

3. 待細(xì)胞球體*分解，加入3倍體積的1X PBS，并用1000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細(xì)胞做分析。

六、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

A、試劑準(zhǔn)備:

1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用37 ℃水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM（不可以用PBS稀釋）等，用于稀釋A膠) 稀釋C緩沖溶液 (10 X) (貨號(hào): B-P-00003-C)至C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。 (例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 如未使用完畢，可保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號(hào): B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*溶解。再將37 ℃水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液取 0.5 mL，加至37 ℃已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度，可降低A膠黏度。(單次使用，勿重復(fù)冷凍解凍 A膠 (1X) )

B、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)步驟

1、準(zhǔn)備適用24孔板的Transwell裝置(例如:康寧Transwell insert, 8 μm PET membrane)。

2、用37 ℃已回溫的C緩沖溶液 (0.5 X)將A膠 (1X) 原液體積稀釋5-20倍，建議一開始可選用15倍。 (根據(jù)細(xì)胞種類做稀釋比例對(duì)比實(shí)驗(yàn)，找出自己實(shí)驗(yàn)體系的稀釋倍數(shù)，稀釋倍數(shù)越高，膠體越軟，越容易穿透)

3、根據(jù)Transwell上室底部面積加入步驟2的 0.1 mL 稀釋后的A膠稀釋液到Transwell上室中。

4、將步驟4在 4 ℃ 冰箱孵育2-3小時(shí)。

5、在Transwell上室中加入0.1 mL 無血清的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞最終濃度約7.5 x 104 cells/well.。

6、在Transwell下室中加入0.8 mL 含10 %血清的細(xì)胞培養(yǎng)液做為chemoattractant，吸引細(xì)胞進(jìn)行遷移及分泌基質(zhì)蛋白酶 (MMP) 侵襲。 (對(duì)照組為Transwell下室中加入含0.8ml無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液)。

7、將細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃, 5 % CO2培養(yǎng)箱孵育24-48 小時(shí)。

8、移除培養(yǎng)液，以PBS 清洗2次。

9、用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細(xì)胞。

10、加入1 ml 100 % 甲醇室溫固定30分鐘,再以PBS 清洗2次。

11、加入 1 ml 0.1 % 結(jié)晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 結(jié)晶紫) 室溫染色20 分鐘，再以PBS 清洗2次。

12、將Transwell移至載玻片上，在顯微鏡下隨機(jī)6-9個(gè)視野觀察計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)。

七、小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序

A、細(xì)胞房?jī)?nèi)材料準(zhǔn)備、試劑制備及步驟

(1) 材料準(zhǔn)備:

1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C緩沖溶液(10X)、4. 無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM，DMEM-F12等，不可用 PBS )、5. A膠 (2X)、6. 細(xì)胞培養(yǎng)液、7. 23-26G針頭、8. 1 mL針筒、9. 細(xì)胞。

(2) 試劑制備:

1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM或DMEM-F12等，不可用 PBS ) 稀釋 C緩沖溶液 (10 X) 至 C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。(例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 若未使用完畢，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號(hào):B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*溶解。再將 37 ℃ 水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液取 0.5 mL，加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)，配置成 1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度，可降低黏度。 (單次使用，勿重復(fù)冷凍解凍 A膠 (1X) )

(3)步驟:

1、取細(xì)胞溶液離心后收集細(xì)胞沉淀，與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細(xì)胞濃度為3*106 cells/mL。

2、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細(xì)胞系懸浮液，按照 2:1 比例均勻混合配置，細(xì)胞懸浮液最終濃度為 106 cells/mL。使用前置于37℃，可降低黏度。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應(yīng)，例如0.5ml C 緩沖溶液(0.5 X)含細(xì)胞加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)

3、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒，抽取步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液至所需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) 。室溫37℃至20℃操作抽取。 (若抽取時(shí)發(fā)生塞針狀態(tài)，可先把針頭拔掉，以針筒進(jìn)行抽取，建議一次抽取配置好所需針筒數(shù)量，避免步驟2 溶液過度凝膠，發(fā)生塞針)

4、將抽取好步驟 3 的針筒，帶入動(dòng)物房, 若短時(shí)間無法施打建議置于冰上。

B、動(dòng)物房?jī)?nèi)材料準(zhǔn)備及步驟

(1)材料準(zhǔn)備:

1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液的針筒、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精)、

3. 手套、4. 實(shí)驗(yàn)小鼠、5. 麻醉小鼠的試劑

(2)步驟:

1、室溫下可直接注射。若是置于冰盒上的針筒，回到室溫后，待液化再進(jìn)行注射。含 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液的針筒，以皮下注射方式，注射實(shí)驗(yàn)所需的體積至實(shí)驗(yàn)鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL，實(shí)際狀況依需求而定)。(針筒放冰上注射阻力會(huì)上升, 放室溫會(huì)液化注射阻力小。注射時(shí)若因凝膠緣故而阻力變大，需緩慢注射避免針頭噴落)

注1 : 注射體積可依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖稣{(diào)整，若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上。

注2 : 此步驟依實(shí)驗(yàn)需求可執(zhí)行或不執(zhí)行，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果，可調(diào)整2.試劑制備將C緩沖溶液 (10 X) 稀釋15倍，變成C緩沖溶液 (0.66 X)，再執(zhí)行后續(xù)成膠實(shí)驗(yàn)；提高C濃度，可提高膠體硬度。

2、培養(yǎng)一至三周后觀察量測(cè)接種的腫瘤尺寸。

注3 : 若為血管生成研究，應(yīng)注射含VEGF及heparin的A膠，以促進(jìn)血管生成。約三天后，可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。