產品貨號：AV1501—A

產品名稱：人尿源間充質干細胞分離培養試劑盒

Human urine- -derived mesenchymal stem cell isolation kit

人尿源間充質干細胞分離培養試劑盒產品描述：

該試劑盒為經過優化的低血清（2%V/V）尿源間充質干細胞（Urine-derived mesenchymal stem

cell, USC）分離培養基。用于選擇性篩選泌尿系統來源的尿源間充質干細胞。低血清和選擇性生長因子、激素的聯合應用確保尿源干細胞在體外環境下的原代篩選和旺盛的增殖活力，配合人尿源間充質干細胞擴增試劑盒可在短時間內收獲大量細胞。

注意事項：

·配好后避光2-8℃保存， 4周內使用完畢

·所有產品請于保質期內使用， 超過保質期， 必須放棄使用

·為確保產品質量，請避免反復凍融相關產品

尿源間充質干細胞(USC)原代提取

1、準備工作：

明膠包被：取適量0.1%明膠包被6孔板， 蓋過孔底即可，鋪平，放置37屯培養箱30分鐘以上，備用

注意事項：

．包被明膠的培養皿在無茼和明膠不蒸干的條件下，可以在4℃保存兩周。

2、尿液收集：

T75培養瓶或無茼取尿瓶表面噴75%酒精消毒，受試者戴無菌手套， 進行200ML或以上尿液收集

注意事項:

●收集尿液之前需對尿道外口進行消毒:男性尿道外口噴75%酒精;女性用75%酒精濕巾擦拭尿道外口3次

●避免晨尿，盡量留取清潔中段尿

●注意無菌操作，勿觸摸瓶口，留取完畢后盡快封閉培養瓶拿至無菌操作間進行后續操作，室外放置

時間不宜過久

3、原代提取:

1) 75%酒精消毒尿瓶外表面，轉移至超凈工作臺，用移液槍將尿液分裝至50ml無菌離心管(4管左右)

2) 1500rpm，10min離心

3)取出明膠包被的六孔板，棄除多余明膠，放置工作臺風干備用

4)離心完畢，棄尿上清，每管保留細胞沉淀不超過1ml

5)其中一管加入20ml PBS， 吹打混勻細胞沉淀

6)將細胞懸液轉移至另一支離心管，吹打混勻，如此反復，直至將所有細胞沉渣懸液匯集于后一支離心管

7) 1500rpm，10min 離心

8)棄上清，12ml USC分離培養基重懸細胞沉渣，2ml/孔接種至六孔板， 記為P0-day1 (原代第1天)

9)此時光鏡下可見大量漂浮尿源多邊形角質細胞，培養皿放置379C培養箱

10)第2天，觀察是否有污染情況(細菌污染:培養基渾濁變黃,鏡下可見細沙狀細菌)

11)第3或4天，每孔加1ml USC分離培養基

12)第5或6天半量換液(棄1ml，加1ml USC分離培養基)

13)第8天左右，光鏡下可觀察米粒樣USC原代克隆形成

14)待克隆形成的形態稍大(第10天左右)，克隆形成孔進行全換液，即棄漂浮細胞，PBS清洗，添加

2mlUSC分離*培養基繼續培養

15)待大片密集克隆細胞形成(第12天左右，融合度達90%以上)，0.25% EDTA- -胰酶消化(尤其細胞克隆密集的地方) , USC分離*培養基重懸細胞，根據細胞量傳至6孔板或10cm培養皿，記為P1代。

16)細胞隔天換液，待P1代細胞融合率達90%左右，0.25% EDTA-胰酶消化，換用USC擴增*培養基重懸細胞，按1: 4比例傳代，進行后續培養。

注意事項:

●一般正常人尿液中的細胞沉淀有時較少，離心后管底不易觀察到，操作盡量輕柔，避免誤吸

●一般正常人200ml尿量可出3~5克隆，較少情況下無克隆產生，與供者身體素質和時間有關

●USC細胞生長較快，待克隆集簇融合成大片，或內部生長空間較小時即可進行消化傳代

●原代細胞培養一般不超過14天，若14天尚無克隆產生，可棄

●為獲得活力旺盛的原代尿源干細胞，原代(P0)與P1代均需用USC分離*培養基進行選擇性篩選，P2代開始換用USC分離*培養基

本尿源間充質干細胞分離*培養基經過原代尿液分離培養性能測試，詳見附圖(1, 2)

質量控制

√無菌檢測(細菌、真菌和支原體檢測)

√ pH測試

√滲透壓檢測

√內毒素檢測

圖一

附圖1人尿源間充質干細胞原代提取流程圖

附圖2人尿源間充質干細胞原代提取、克隆形成圖片(光鏡: 100X )

day5~9可見米粒樣集簇細胞克隆形成，day10~14細 胞克隆融合成大片可進行消化傳P1代